在大鳥圭介的組織下，舊幕府軍分成前中後三軍，土方歲三擔任前軍參謀。四月十一日大軍離開江戶，朝會津方向行進，途中在宇都宮一帶與新政府軍爆發攻防戰，土方歲三足部受傷，把舊新選組隊員交託給齋藤一之後，被送到會津若松城療養。土方歲三在會津療養期間，在流山失散的舊部屬紛紛前來投靠；此外他得知近藤勇死訊，在當地天寧寺為近藤勇立墓祭拜。
土方歲三療養了三個月才痊癒，這時候新政府軍已攻至會津，八月二十一日，雙方在會津豬苗代湖東北方的母成峠激戰，舊幕府軍寡不敵眾，舊幕府軍往會津若松城方向撤退。新政府軍乘勝追擊，在十六橋擊破會津藩兵，導致少年白虎隊在飯盛山上集體切腹自殺的慘劇。
因為新政府軍追擊甚急，舊幕府軍來不及入城，留在若松城外駐守。土方歲三和大鳥圭介前往米澤求援，齋藤一則決定留在城中抗敵。此後一個月，齋藤一率領舊新選組隊員，與會津藩兵在城外抗戰，舊新選組隊員幾乎陣亡殆盡，齋藤一力戰至最後一刻，隨著會津藩主松平容保一同向新政府軍棄械投降。
土方歲三和大鳥圭介前往米澤藩請求援兵，可是米澤藩已經表示歸順新政府了。接著他們計劃前往庄內藩，但被米澤藩所阻，於是轉向仙台。途中與舊幕府海軍副總裁榎本武揚會合，一起到仙台藩說服藩主出兵支援。在奧羽越列藩同盟會議上，榎本武揚建議由土方歲三出任名盟軍總督，但土方歲三治軍極嚴，同盟方面都不願意由他領軍；隨著新政府軍步步進逼，仙台藩內恭順派家臣驅逐了主戰派家臣，使仙台藩放棄抵抗立場。土方歲三等人唯有離開仙台，乘坐榎本武揚率領的艦隊，前往蝦夷地（北海道）作最後的抵抗。當時以榎本武揚為首的舊幕府軍，集合了各地的敗兵，總數尚有二千人之眾，其中舊新選組隊員雖然所剩無幾，這時候卻有不少新成員加入，人數接近一百。
十月二十三日，土方歲三所乘坐的大江丸登陸蝦夷鷲木濱，與其餘部隊合流後，分海陸兩路進攻當地新政府軍最大的據點箱館五稜郭（屬松前藩）。十月二十六日，大鳥圭介率先進城，佔領了五稜郭。接著舊幕府軍攻陷了松前藩最後的據點江差，以此作為對抗新政府的根據地。傳說混亂之際松前藩主夫人匿藏於民居，被舊幕府軍士兵發現，眼看著要受辱，得土方歲三挺身相救，成為一時美談。
十二月十五日，舊幕府軍在箱館舉行祝捷會，並邀請各國領事參加。同場還上演了一場日本史上破天荒、劃時代的創舉，就是宣布成立蝦夷共和國，並且由士官以上級別的成員投票選出政府官員。經選舉後，選出榎本武揚為共和國總裁，松平太郎為副總裁；土方歲三與大鳥圭介一起出任陸軍奉行，並兼任箱館市中取締和裁判局頭取，即一身兼任陸軍、治安和司法部門的首長（為行文方便，以下一律稱蝦夷共和國軍隊為蝦夷軍）。
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| 土方歲三 |
翌年（明治二年，１８６９年）三月下旬，蝦夷軍突襲新政府軍停泊於陸奧宮古灣的軍艦。土方歲三亦有參與這場戰鬥。蝦夷軍回天艦悄悄地靠近新政府軍的甲鐵艦，但沒法奪得船艦，反而折損了許多士兵，加入新選組不久的蝦夷軍陸軍奉行添役野村利三郎亦在海戰中戰死。
宮古灣作戰失敗後，蝦夷軍只得退守箱館，從此採取防守姿態。四月九日，新政府軍登陸北海道，分海陸兩路圍攻蝦夷軍。土方歲三在江差與箱館之間的市渡一帶布陣，多番擊退新政府軍的攻勢，可是後方箱館部隊被擊敗，土方歲三恐怕被切斷退路，於是撤退到五稜郭內。
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| 五稜郭古圖 （圖片來源：https://www.goryokaku-tower.co.jp/history/） |
蝦夷軍除了五稜郭外，其他地方都保不住了，滅亡只是時間問題。五月十一日，新政府軍對五稜郭發動總攻擊。在市街爭奪戰中，土方歲三一馬當先，從一本本關門跑到異國橋附近時，肚腹中了流彈，墜馬死亡，終年三十五歲。六日後，榎本武揚向新政府軍投降。歷時一年餘的內戰正式結束。
土方歲三戰死前，曾把自己頭髮剪下來，連同自己的照片及親筆所寫的和歌交給身邊的小姓市村鐵之助，命他帶回江戶日野佐藤彥五郎（土方歲三的姊夫）的家。市村鐵之助不從，寧願跟主人一同戰死沙場，土方怒喝道：「如果你不走，我現在就將你斬了！」便安排船隻將市村鐵之助送回江戶。市村抵達佐藤彥五郎家，是在榎本武揚降伏後的七月上旬。他將土方歲三交託的遺物交給佐藤彥五郎，在佐藤家住了三年，便回到故鄉美濃去。
那首和歌，這樣寫道：
たとひ身は蝦夷の島根に朽ちるとも 魂は東の君やまもらん
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