從六月末起，新選組便奉命與會津藩兵一同鎮守京都外圍的九條河原，防範長州藩兵的攻擊。但率先打響頭炮是在將近一個月後的七月十九日深夜，福原越後沿伏見街道北上，在藤森一帶遭遇駐守的大垣藩兵炮擊，福原部隊還擊，把大垣藩兵擊退；其後福原部隊行進至深草寶塔寺，被埋伏街道兩旁的幕軍突襲，潰不成軍，福原越後受了槍傷，率殘部往山崎方向撤退。部份藩兵逃到九條河原附近，被守候多時的新選組一網打盡。
稍晚，京都御所蛤御門外，國司信濃所率領的長州藩兵和會津藩兵爆發衝突。激戰當中，西鄉隆盛率領薩摩藩兵支援會津，長州藩兵登時處於劣勢，長州藩士來島又兵衛當胸中了槍，傷勢甚重，當場切腹自殺。
國司信濃部隊潰敗之後，長州藩士久坂玄瑞和久留米藩士真木和泉率領部隊轉攻御所南面的堺町御門，那裡有越前藩兵駐守。長州藩沒法突破敵方陣地，久坂玄瑞逃入附近的公卿鷹司邸內自盡。真木和泉脫離戰場，集合敗兵往天王山逃去。
長州藩全面敗北，會津藩和新選組在戰場周邊民居搜捕隱匿的長州藩兵。衝突雖然在一天內結束，但戰鬥期間雙方縱火和大砲轟擊附近民居，大火連續三日不熄，南面兩公里遠的東本願寺也遭大火波及。市內許多街町和寺社被燒燬。京都遭受自十五世紀應仁之亂以來最嚴重的破壞。
逃往天王山的真木和泉，出身筑後久留米藩的神官家庭，自幼學習國學，成人後遠赴水戶，拜會澤正志齋為師，學習水戶學，有很強烈的尊王攘夷志向。他和長州藩的攘夷志士相善，甚至向長州藩主毛利慶親進言，謂僅憑長州一藩是沒可能對抗外夷，必須全國同心一致才有力量，而要全國同心一致攘夷，必先由天皇發施號令才行。他從此參與長州藩的尊王攘夷運動。
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| 真木和泉銅像 |
長州藩三路部隊敗走之後，真木和泉收拾殘部退守天王山，總共才十七人。七月二十一日，即御所爆發衝突的第三日，會津、桑名、彥根等藩派出士兵前往天王山掃蕩餘黨，近藤勇挑選土方歲三、永倉新八等五十名隊員助陣。諸藩兵在山下包圍，新選組則聯同神保內藏助率領的會津藩兵擔當先鋒上山搜捕。由於天氣炎熱，新選組隊員都脫下甲冑，輕裝出擊。
因為不知道殘黨人數和位置，近藤勇等人步步為營，深怕中了敵人埋伏。到達山頂，赫見真木和泉等人早已架好鐵砲，向新選組亂槍掃射，永倉新八和井上源三郎受輕傷。一輪掃射之後，真木和泉率領殘部退入旁邊的武器庫，引火焚屋，真木和泉和同伴一同切腹自盡。待火勢殆盡，眾人在屋內發現的是十七具焦屍。
剿滅了真木和泉餘黨之後，京都之亂大致平息。新選組馬不停蹄前往大坂搜捕餘黨，沒收長州藩的武器，並燒燬當地的長州藩邸，返回京都壬生屯所已是七月二十三日。事後朝廷宣布長州藩為朝敵，並褒揚新選組保衛御所的功勞。
新選組簡史 系列
新選組簡史（一）——清河八郎
新選組簡史（二）——會津藩下的壬生浪士組
新選組簡史（三）——芹澤鴨的惡行
新選組簡史（四）——八一八政變
新選組簡史（五）——池田屋事件
新選組簡史（六）——禁門之變
新選組簡史（七）——伊東甲子太郎
新選組簡史（八）——山南敬助脫隊事件
新選組簡史（九）——分裂
新選組簡史（十）——鳥羽伏見之戰
新選組簡史（十一）——近藤勇的末路
新選組簡史（十二）——土方歲三最後的抵抗
新選組簡史（十三）——新選組的餘生
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